#生物繼代培養(subculture) | 自然科學板

最近實驗室在找專題生，想說來拼個預研所以果斷跟了我們普生老師(輻射生物學專業)的老師，老師請了一位預研生(但他現在是碩二)來帶我實驗。我們實驗室研究方向就是輻射生物學，所以下一次有空的時候我來稍微介紹一下我們的Flow cytometric實驗，今天想和大家分享最近一個還滿愛的實驗(超愛養細胞的！):繼代培養(Subculture) 【實驗名稱】繼代培養(Subculture) 【實驗目的】(白話文)幫細胞搬家，不然他們養分不夠會打架(7~9成滿的時候要搬家) 【實驗注意事項】 ①操作抽風櫃和培養箱的時候一定要帶手套，而且要噴酒精，酒精要噴到操作界線的尾巴。 ②抽風櫃的原理就是雙抽風，會形成一個鳳牆，所以不能拉太高，操作時要關UV燈。 ③PBS和Medium(等下解釋)從冰箱取出後要放水域回文，撕掉膠帶後可以稍微火烤瓶口。【使用藥品及器材】 ①PBS(Phosphate Buffered Saline) 磷酸鹽緩衝溶液:簡單來說就是Buffer ②Medium(培養液的統稱):我們實驗室的Medium有包含: ⑴10%的FBS(Fetal Bovine Serum)可以作為血清。 ⑵1%的sodium pyruvate可以作為碳源。 ⑶1%的NEAA(Non-essential Amino Acid)非必須胺基酸。 ⑷PSA(抗生素)會需要抗生素的原因是因為，我們實驗室的癌細胞都是從人體取出的，對於癌細胞來說他們是沒有抗藥性的，所以會丟一些抗生素進去，讓他產生抗藥性。 ③Trypsin(胰蛋白酶) ④細胞廢液桶 ⑤離心管 ⑥pipette和autopipette(高中是用分度吸量管，大學的話會有一個類似的東西，翻譯移液管) https://i.imgur.com/68TNxd4.png 這個上面可以轉，轉到你要的scale再吸起來，一支沒記錯是5000多吧，沒打折的話。 ⑦Trypan Blue(染色劑)活細胞和死細胞可以吸收，但是活細胞會吐出來，也因此可以用Trypan Blue去數活細胞 ⑧96孔格 ⑨計數器套包【操作實驗】前置一定是養好細胞，然後放在顯微鏡下面發現他長到7成滿左右的時後我才會去動他。以下的單位都是10cm的dish(培養皿)的scale ⑴把舊的Medium抽出來(注意為什麼是Medium可以參考最後一個步驟)這個步驟的話可以用pipette ⑵加入約5cc的PBS，讓PBS可以wash一下，加入的時候要沿著培養皿的皿壁加入，這個也是用autopipette ⑶wash完之後把PBS抽出來，這個步驟也可以用autopipette ⑷加入1cc的Trypsin，這個步驟比較有趣，為什麼我們要加入胰蛋白酶？因為顯微鏡下我要確定細胞是活著的狀態的話，我要確定細胞是固定不動的，原因是因為細胞在生長的過程中會產生一個叫「細胞外基質」的東西，主要是蛋白質，所以我加入Trypsin可以把他分解，但也不能加入太久，不然Trypsin也會把細胞本身的蛋白質分解掉，所以加入trypsin之後我只能讓他作用3~5分鐘。(這個階段要放在培養箱裡面讓他作用) ⑸拿出來後加入4cc的Medium，加入Medium的原因上面找得到，因為我們實驗室的Medium有加血清，血清本身有抑制劑的功能，為了要抑制trypsin，不要讓trypsin一直作用下去(知識補充一下，能當抑制劑的角色有兩個，第一個是血清，第二個是對應到的抑制劑，比較不會有實驗室買後者，畢竟很貴)，這個時候把細胞放到顯微鏡下可以發現細胞開始游動了。 ⑹把你弄出來的所有東西全部吸出來放到離心管內，這邊要開始離心了，所以我們來複習一下【離心機內必須維持平衡】所以如果你是只做一管的實驗，要先拿去天平那邊和一個空管做平衡，空管內要加水。之後放入離心機，離心機上面有幾個數字: ①時間:一般癌細胞是3~5mins ②溫度:37°，人體溫度 ③轉速:能分離癌細胞又不會破壞癌細胞的轉速是1300~1500rpm(rotate perminute)，特別注意到的是，離心機上的轉速會*1000倍，所以設定的時候選1.3~1.5就好了。 ⑺把離心管拿出來後，把上清倒掉(不能猶豫喔，直接倒掉，不然會回遊)但這個步驟也可以用pipette，如果你要管內吸得比較乾，那當然是用pippette，不過這個實驗可以直接倒掉，反正後來會加入新的medium ⑻加入5cc的Medium到離心管中，使用pipette潤洗大約10~20次，讓細胞可以均勻的混合在Medium中。這個過程叫做回溶 ⑼開始數細胞！數細胞的功能是因為我們要知道自己要培養多少細胞~ 【單位:1L=1000mL】【單位:1mL=1000μL=1000λ】首先，我們抽出10λ的cell到96孔格，再加入40λ的trypan blue 進行稀釋(相對的，稀釋倍率是5x)接下來，把蓋玻片放到計數板上，蓋住9攻格，然後用pipette把稀釋後的cell整個丟入計數板後開始數，數的時候拿計數器按，算九宮格內有多少活著的cell(因為死cell不會吐出trypan blue所以會和背景的藍色相同，只要數我看到的白色就好了)然後九宮格的四個邊都不要計算。 ⑽換算: (總數量/格數)*稀釋倍數*10⁴=多少個/ml 這個部份的話，國中應該有說過了，我就不多解釋嘿。算出來之後我就可以開始養細胞了，如果假設我得到的是10⁴個/ml，今天我要養3*10⁴個細胞的話，我就要取3ml下去養。這就是為什麼我要計算細胞數的原因了，這樣才能控制在2~3天後做實驗的細胞都是最營養的了。好，這就是subculture的大概形式，對於這類有興趣的人歡迎考來高醫(?)沒，我是說，不要來這個鬼地方，什麼研究都要收錢，幫忙洗機器也要錢，有夠摳門(這段請忽略) 那如果有興趣的人歡迎留言讓我知道，下次我要發的是flow cytometric，這個就是跟臨床上的化療和radiation很有關係的了，但畢竟是專題，所以我只會介紹機器的使用法和研究方向，真正的操作和數據以及原理會盡量簡單帶過。