好的，上次的文章中我們已經提到了該如何去做culture和subculture，但這只是所有實驗室的基本功，包含這次要說的Western Blot也是很多實驗室的基本功其他的技能概括像是ELISA或是flow都是偏中間的，又專業又不算專業的技能，如果這篇的反應很好的話我下次應該會來寫看看Tumor sphere assay或是MTT asay之類的比較專業的技能，廢話不多說，我們進入正文吧。
---------- 正文 ----------
首先，我們要知道這項技術是根據什麼原理進行的一個操作，所以我們先看整體操作流程。
★首先整體作業:
Culture細胞→Subculture細胞→加入treat(drug或是radiation)→收下cell的protein(protein extraction)→蛋白質定量(BCA Solution assay)→Western blot
實驗室都會養特別的細胞，像我們養癌細胞就是為了要對他做一些處理(例如說加藥或是照放射線)去看看他會不會影響到他的細胞週期(這項技術是和flow cytometric有關)，第二個的話是我們要去看他會不會影響到他蛋白質的表現，而這個的話我們就是應用到Western blot的技術。
https://i.imgur.com/v7GtXHZ.jpg
(flow的話是跟cell cycle 和check point以及repair protein有關，所以大多都是研究癌症的團隊才會做到)
最一開始我們對處理過的細胞做一個固定的動作，大多實驗室都是用酒精去固定細胞，這個動作有點像是製作標本的過程，固定細胞的主要原因是因為，我需要有實驗組和對照組，假設我今天要看的因素是時間因素(例如說照完放射線後一至八小時間的癌細胞)，我不可能過八個小時才開始收蛋白質，而是應該要先固定細胞再一起收蛋白質(中間用到像是phosphotase或是RNase之類的有的沒有的我下次再寫文章)。
收完蛋白質後就進入Western Blot的動作了，首先我們先將膠調好，膠會分成上膠(stacking gel)和下膠(separating gel)上膠的功能是為了將protein壓密，而下膠的功能是為了讓protein區分開來，調膠的材料大多都相同但是比例不同，像我們實驗室是習慣調5%的膠，顆粒過得去，膠進得來，實驗室發......沒，我是說，這樣跑出來的protein sample比較漂亮。調完後我們會用一個東西叫做齒梳在上膠上 https://i.imgur.com/43IkiXS.jpg
然後我們就會有孔洞可以讓我們load蛋白在上面，我們的蛋白會加一個染色的marker，方便我們知道protein跑到哪裡去了(因為protein是透明的)
https://i.imgur.com/8d3TstP.jpg
這邊沒有打算多做太多的設備介紹，所以只簡單說一下，設備是由雙邊的跑膠器結合在一起，中間需要倒入全新的running buffer，如果實驗室有錢的話旁邊可以到新的running buffer，但我們實驗室比較窮所以是倒reuse的running buffer。
然後我們就可以開始準備跑膠了
https://i.imgur.com/xBuTKuJ.jpg
跑完膠之後(流程大概兩小時)marker會完全跑到gel的最下面，這個時候我們要把膠上的蛋白質transfer到membrane上面，要transfer的主要原因有二，第一個原因是因為gel比較軟，在做的時候很容易爛掉，第二個是因為gel會抓protein，所以在做blocking或是一二抗的時候(後面會解釋)會全吸，在做orbit的時候會很難做。反正就是我們要transfer到membrane上面，而transfer的器材很像是上面跑膠的設備，只不過中間有夾gel和membrane和海綿之類的東西，只談技術層面部份的話，內部是要倒入transfer buffer，就會開始transfer了，transfer的過程會放熱，使得轉換效率降低，也有可能讓gel直接融化到membrane上面，所以我們要在冰域做transfer。
Transfer到membrane上面之後就可以開始做我們的實驗了，首先我們將membrane泡到marker中(好像大多實驗室都用不同的marker?)然後我們就可以得到類似這樣的影像
https://i.imgur.com/fPHKpvt.jpg
這上面一條一條的就是我們的蛋白質，我們要對應到Western blot官方給的一個對應表去對應marker和位置找出我們的目標protein，並且剪成一小條(這裡會預先在一小條上面大分子量或是小分子量的地方剪一個小口，方便辨認)
接下來我們放入保險盒之中開始做blocking，這邊介紹一下blocking其實就是把脫脂奶粉的TBST溶液倒入保險盒中，因為membrane會抓protein，所以如果我在後面要加入anti-body，並且忘記要blocking的話，整張membrane都會吸滿anti-body。所以我要做一個blocking的動作。
https://i.imgur.com/N8t8lXv.jpg
blocking一次要做30分鐘，大概做四輪。要放在shacker上面讓他轉。
做完blocking後，我們就要加入抗體了，加入抗體會有兩種，第一個就是所謂的一抗，也就是針對我要的那個蛋白去辨認的抗體，第二個抗體叫做二抗，二抗是針對一抗的種類去辨認的抗體，舉例來說，如果我要辨認的是兔子的β-actin這個蛋白好了，那我一抗就會加入anti-β-actin，而二抗就會加入兔子的一個antibody，每一次加完抗體之後，都要放在shacker上面讓他作用三十分鐘，作用四輪左右，每一輪間隔都要用TBST wash，因為抗體的結合有專一性結合和非專一性結合，我們要去除非專一性結合，因此我們要把他wash掉。
一二抗做完後就要去壓片了，壓片的話每個實驗室都用不同的機器，所以我只講原理，原理就是講顯影劑滴到membrane上面，例如冷光顯影劑，接著拿去機器下面拍照。
最後我們講一下結果，假設你得到的結果是這樣
https://i.imgur.com/KSyD36s.jpg
如果左邊是沒有加treat的對照，右邊是有加treat(看你是Induce的還是repress的treat)，我們可以發現他protein的表現量有所改變，這就可以拿來證明我加這個藥是對細胞有影響的。
✔這就是俗稱的化療，這個工作可以找出化療藥劑量搭配多少劑量的游離輻射可以最有效的殺死癌細胞，而flow的搭配則是可以看出什麼時候照放射線，對人體的傷害最大卻可以轟炸掉最多的癌細胞。
好的，今天的介紹大概到這邊 有興趣的話，呃，考醫學系ㄅ，醫學系有在做這種實驗只是比較少啦，大多針對癌細胞或是一些怪異的細胞。
有問題歡迎提問，沒問題的話我們下次見
(然後我寫的很簡略，所以神人等級ㄉ打小力一點ㄅ)
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看起來跟TLC蠻像的，就是換成跑protein然後顯色很麻煩就是了 我好奇的有二： 一是你有提道矽膠會抓protein，menbrance也會抓，那麼為什麼menbrance在block之後就沒問題了？可以直接拿矽膠block嗎？ 二是transfer這一步驟為什麼會放熱？如果不涉及chemical rxn的話應該沒有這個問提吧，因此不是很懂這裡。
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先回答為什麼要做transfer的動作，因為跑出來的gel和原本看起來一模一樣，做transfer的好處是，membrane會抓protein，所以我抓到membrane上再泡marker就可以看出哪裡有bend，會比較好處理，而做western的時候，sample放到gel上，但實際上gel是有厚度的，所以protein在跑的時候不是類似在紙上跑，而是卡在一個空間中，transfer之後會全數抓到membrane上面，這也是為什麼要做transfer，另外一個我在猜測的原因是因為，gel是透明的，而且老實說有點難切，萬一沒有顯色的情況下切歪了，整個data的可信度就會下降，所以才會transfer。最後我做整個實驗會跟membrane有關，gel就可以丟掉了，所以這個時候就不會有gel的問題了。再來討論blocking，blocking是為了塞membrane抓protein以外的區域，避免一抗和二抗結合上去，所以我們才會用脫脂奶粉(泡TBST，我們實驗室是用5%的奶粉去blocking) 至於為什麼transfer會放熱我還真的不太確定，但我在猜是因為transfer buffer裡的離子做redox的原因，猜測的主要原因是因為transfer buffer有分全新的和回收的，而內部是transfer的中心，只能倒入全新的，而不能倒入回收過的，並且reuse transfer buffer只能用三次左右，所以才會這麼猜測，但具體的理由我不是很確定。 希望這樣有回答你大部分的問題
B2 其實我覺得這項技術最關鍵是因為這項技術是主流可以拿來證明你的treat對於細胞的影響是真的有效的，我覺得其中最重要的步驟在於蛋白質定量和最後的顯影，因為中途如果出錯，像是blocking的奶粉用太高%數，頂多是讓畫面看起來有很多雜質，不至於會毀掉實驗，但是如果蛋白質定量出了差錯，那就是一開始的步驟錯誤，而顯影的技術，其實很多人都不太會弄，因為他是照片的疊加，產生的陰影過大的話，你也很難說服別人說那個到底是蛋白質還是陰影
我想了想，會不會是membrane本身既會和protein反應也會跟抗體反應，所以要用不跟抗體反應的其他蛋白質block掉membrane? 也就是protein會用某種bonding固定在membrane上面，因此放熱？protein很難用泛用化學方式顯色，所以顯色是用加的抗體上的標記這樣。
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protein顯色的確如此，然後我們會說是壓片，其實原理就和CCD有點類似，然後我覺得放熱應該不是出在transfer裝置，應該是buffer，因為buffer很明顯的比transfer裝置熱很多，而且是真的摸起來溫溫的，而不是室溫的感覺，transfer的裝置是兩片夾片，中間放海綿→濾紙→membrane→gel→濾紙→海綿，所以如果是protein bond上去的話，照理來說不該是這個結果
B5 我今天遇到大學長，問過了所以來更新 ①為什麼不用gel直接blocking做呢？ 因為gel是有厚度的，而我們是將我們的sample load在上面，是三維的空間，也就是說，在gel中會卡著protein，所以如果我們直接blocking的話只能抓到一層二維平面而已。但最大的問題是，gel是用分子量差別去「卡」protein的，也就是說gel不是真的會吸收protein，而是用卡的，所以無法blocking也無法做一抗二抗。經過transfer後，protein會跑到membrane上，membrane本身是二維平面，所以不會有這些問題 ②放熱的原因？ 因為有插電就會放熱。
有插電就放熱這句嘴角失守www 確實忘記這點了
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